QUANTIFIKASI DNA DAN ANALISIS KUALITAS

Standard

Pendahuluan

Analisis kuantitatif merupakan salah satu teknik analisis yang bertujuan untuk menentukan jumlah atau seberapa banyak suatu zat atau komponen zat (Harjadi 1986). Aplikasi yang dapat dimanfaatkan dari teknik analisis kuantitatif adalah menghitung jumlah DNA atau RNA dalam suatu larutan, yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan uji kualitatif. Analisis kuantifikasi DNA dapat dilakukan dengan bantuan alat, yaitu spektrofotometer. Spektrofotometer adalah alat yang dilengkapi dengan sumber cahaya (gelombang elektromagnetik), baik cahaya UV (ultra-violet) atau pun cahaya nampak (visible). Komponen utama dari alat ini adalah sumber cahaya, pengatur intensitas, monokromator, kuvet, detektor, penguat arus dan indikator atau layar (Braun 1982).

Sinar UV digunakan untuk mengukur bahan larutan yang terbaca dengan panjang gelombang di bawah 400 nm. Sinar visible light bisa digunakan untuk mengukur bahan dengan panjang gelombang 400-700 nm. Sumber cahaya dari alat tersebut memancarkan seberkas cahaya melalui dua buah lensa dan celah masuk ke suatu sisi difraksi yang akan menyebarkan cahaya menjadi berkas horizontal dengan semua warna spektrum. Cahaya yang mengenai suatu benda dalam larutan contoh akan dihamburkan, sedangkan cahaya yang lolos atau diteruskan akan melewati sampel akan mengaktivasi fototabung dan akan menampilkan persen trasmitan. Biasanya Absorban merupakan daya cahaya masuk dan daya cahaya yang diteruskan melewati larutan contoh (Day & Underwood 2002).

Absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasi, artinya konsentrasi semakin tinggi maka absorbansi yang dihasilkan makin tinggi, begitupun sebaliknya konsentrasi makin rendah absorbansi yang dihasilkan semakin rendah. Semakin banyak jumlah DNA yang terkandung dalam larutan, maka semakin kecil cahaya yang dapat diloloskan(Keenan 1992).

 

Pembahasan

Spektrofotometri sinar UV digunakan untuk mengukur tingkat kemurnian DNA hasil isolasi. Blanko atau larutan contoh dimanfaatkan untuk menstabilkan absorban akibat perubahan voltase atau intensitas cahaya dari sumber (Hayani & Fatimah 2002). Larutan blanko yang di gunakan pada praktikum ini adalah ddH2O. DNA memiliki nilai tingkat kemurnian yang tinggi jika nilai absorbannya antara 1.8 sampai 2.0, jika melebihi nilai 2.0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan dari protein membran atau senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid yang didapat belum murni. Jika kurang dari 1.8 makan ddH2O yang diambil terlalu banyak sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit.

Penentuan panjang gelombang maksimum perlu dilakukan untuk mengetahui dimana terjadi absorpsi maksimum dan untuk meningkatkan proses absorpsi larutan terhadap sinar (Rohman 2007). Panjang gelombang yang digunakan untuk mengetahui kandungan DNA/RNA menggunakan spektrofotometri UV adalah 260 nm, sedangkan untuk mengetahui kandungan protein menggunakan spektrofotometri UV dengan panjang gelombang 280 nm. Praktikum ini menggunakan panjang gelombang yang sama dengan yang dijelaskan di atas, karena untuk mengetahui kemurnian DNA plasmid yang diisolasi dan memastikan tidak ada kontaminan protein dalam larutan.

Nilai kemurnian suatu bahan ditentukan dengan nisbah rasio λ 260/280 yang menyatakan kualitas DNA tersebut (Isda et al, 2008). Nilai nisbah rasio pada praktikum kurang dari 1.8, ini berlaku untuk semua kelompok. Artinya DNA plasmid yang diisolasi belum sempurna murni, masih terdapat zat yang tidak diinginkan, misalnya protein. Nilai absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasi, artinya konsentrasi semakin tinggi maka absorbansi yang dihasilkan semakin tinggi. Terlihat pada tabel 1, nilai konsentrasi sebanding dengan nilai absorbansi panjang gelombang 260, menandakan jumlah DNA yang terkandung dan konsentrasinya. Jika nilai konsentrasinya tinggi maka nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 juga tinggi misalnya pada kelompok 4 yang plasmidnya memiliki nilai absorbansi 0.134 dan konsentasinya adalah 1173 ng/µl.

 

Simpulan

Panjang gelombang yang digunakan untuk mengetahui kandungan DNA/RNA menggunakan spektrofotometri UV adalah 260 nm, sedangkan untuk mengetahui kandungan  protein menggunakan spektrofotometri UV dengan panjang gelombang 280 nm. Nilai nisbah rasio λ 260/280 pada praktikum ini kurang dari 1.8. Artinya DNA plasmid yang diisolasi belum sempurna murni, masih terdapat zat yang tidak diinginkan, misalnya protein. Absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasi, artinya konsentrasi semakin tinggi maka absorbansi yang dihasilkan semakin tinggi, begitu pula sebaliknya.

Tujuan

Mengetahui dan dapat menghitung konsentrasi DNA / RNA serta dapat menganalisis kualitas DNA / RNA.

About these ads

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s