TRANSFORMASI BAKTERI

Standard

Pendahuluan

Transformasi DNA merupakan salah satu metode untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri (Cowell & Austin 1997).  Metode ini sekarang secara luas dipakai untuk mentransfer plasmid kecil dari satu galur bakteri ke galur lainnya (Hanahan  1983). Prinsip dari transformasi adalah dengan ekstraksi DNA dari sel donor, kemudian dicampur dengan sel resipien yang telah dibuat rentanterhadap masuknya molekul DNA melalui pori atau saluran dalam dinding dan membran sel (Cowell & Austin 1997).

Keberadaan DNA asing yang berintegrasi dapat menyebabkan sel yang mengambilnya berubah sifat (Jusuf M 2001). Kemampuan bakteri mengambil material dari lingkungan sekitarnya dapat didukung oleh proses perlakuan konjugasi atau perlakuan fisik dan kimia atau transduksi. Bakteri yang digunakan pada praktikum ini adalah Escherichia coli.Sebelum proses transformasi dilakukan bakteri ini perlu dibuat menjadi sel kompeten agar E.coli dapat mengambil DNA dari lingkungannya (Widodo 2002). Seleksi bakteri pembawa DNA rekombinan dapat dilakukan dengan resistensi antibiotika misalnya ampisilin dan seleksi warna salah satunya teknik seleksi biru putih. Seleksi biru putih yaitu metode untuk memisahkan sel yang mengandung plasmid rekombinan dengan sel yang mengandung plasmid tanpa insert (Brown 1995). Seleksi biru putih dilakukan untuk mengetahui keberhasilan proses ligasi atau keberadaan DNA sisipan. Metode ini menggunakan media yang mengandung X-gal dan IPTG (Isopropil Thiogalaktosida). Koloni yang berwarna biru artinya tidak mengandung DNA sisipan, sedangkan koloni berwarna putih artinya DNA bakteri mengandung DNA sisipan.

 

Tujuan

Percobaan ini dilakukan untuk mengetahui cara introduksi DNA ke E.coli

 

Metode

  1. Pembuatan sel kompeten

Satu koloni bakteri Escherichia coli diambil dengan tusuk gigi steril dan dibiakkan dalam eppendorf yang berisi 500 μl TFB (Transformation Buffer). Resuspensi dilakukan terhadap tabung eppendorf (vortex). Selanjutnya, eppendorf diinkubasi di dalam es selama 5 menit dan disentrifuse pada 5000 rpm selama 5 menit. Endapan (pelet) hasil sentrifuse ditambahkan dengan 500 μl TFB dan diresuspensi atau divortex kembali. Setelah itu, ditambahkan 1/12 volume TFB dan DMSO ± 20,8 μl. Campuran diresuspensi dan kemudian diinkubasi di dalam es selama 10 menit.

Pembuatan sel kompeten terdiri dari dua metode yaitu, di dalam laminar dan di luar laminar. Kelompok kami melakukan metode yang kedua yaitu pembuatan sel kompeten di luar laminar.

2. Transformasi bakteri

Sebanyak 50 μl sel kompeten diambil dan ditambahkan dengan 10 μl hasil ligasi, lalu diinkubasi di dalam es selama 20 menit. Campuran tersebut kemudian segera dipanaskan (heat shock) pada 42oC selama 45 detik. Setelah perlakuan heat shock, campuran diinkubasi di dalam es selama 5 menit. Campuran ditambahkan dengan 100 μl YT dan diinkubasi kembali pada suhu 37oC pada shaker kecepatan 250 rpm selama 20 menit. Tahap akhir adalah bakteri disebar di atas media padat. Komposisi media pertama (kontrol +) adalah LA (Luria Agar), media kedua (kontrol -) berisi LA dan ampisilin, media ketiga (kontrol transformasi) berisi Luria Agar, X-gal, dan IPTG.

Pembahasan

Seleksi biru putih (blue-white screening) yaitu metode untuk memisahkan sel yang mengandung plasmid rekombinan dengan sel yang mengandung plasmid tanpa insert. Seleksi biru putih dilakukan untuk mengetahui keberhasilan proses ligasi atau keberadaan DNA sisipan. Metode ini menggunakan media yang mengandung X-gal dan IPTG (Isopropil Thiogalaktosida) (Brown TA 1995). Transforman yang dihasilkan ada yang berwarna biru dan putih, adanya warna biru karena senyawa X-gal dalam medium (Wibowo 2002). Hasil transformasi terlihat bahwa koloni berwarna putih terbentuk pada cawan dengan penambahan X-gal dan IPTG serta pada kontrol positif tanpa perlakuan. X-gal adalah molekul yang mirip galaktosa, sedangkan IPTG merupakan inducer enzim β-galaktosidase. Hasil ini sesuai dengan literatur yang mengatakan, terbentuknya koloni berwarna putih ini berarti sel bakteri mengandung DNA plasmid rekombinan dan proses ligasi dinyatakan berhasil (Brown 1995). Jika proses ligasi atau penyambungan fragmen DNA tidak berhasil ditandai dengan warna koloni berwarna biru, sehingga dapat dikatakan percobaan meligasikan dan transformasi fragmen DNA berhasil dilakukan karena terdapat koloni putih. Jika koloni berwarna biru artinya proses transformasi yang dilakukan tidak berhasil hal ini dapat terjadi karena ukuran insert terlalu kecil sehingga tidak mampu membuat gen lacZ terinaktifasi atau posisi sisipan yang tidak tepat, dan insert  yang diklon bersifat meracuni bagi sel bakteri.

Proses transformasi bakteri diawali denga pembuatan sel kompeten. Pencampuran sel kompeten dan DNA insert diinkubasi bersama dengan larutan kalsium klorida (CaCl2) yang terdapat pada TFB, fungsi larutan ini adalah megganggu keseimbangan kalsium dalam membran sehingga membran berhasil terbuka dan DNA insert dapat masuk. Cara kerja larutan ini adalah membantu terbukanya protein integral sebagai kanal ion. Proses selanjutnya yaitu dikejutpanaskan (heat shock) pada suhu 42°C selama 45 detik dengan maksud membran sel akan tertutup kembali karena terjadi perubahan suhu yang mendadak dari suhu rendah ke suhu tinggi. Proses pengerjaan transformasi dapat dilakukan di dalam laminar ataupun di luar laminar. Perbedaannya hanya pada kesterilan kerja dan resiko kontaminasi pada pekerjaan di luar laminar.

Transformasi dikatakan berhasil apabila rangkaian DNA yang diintroduksikan dapat disisipkan ke genom sel inang (bakteri), diekspresikan, dan terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel berikutnya. Seleksi bakteri pembawa DNA rekombinan dapat dilakukan denan dua cara yaitu seleksi resistensi antibiotika dan seleksi warna. Sel yang mengandung plasmid tanpa insert ditumbuhkan pada media LA dan ampisilin tersebut maka gen lac-Z akan terekspresikan dan β-galaktosidase dihasilkan serta menghasilkan koloni biru. Enzim ini akan memecah X-gal dan menghasilkan senyawa berwarna biru, begitu pula sebaliknya, jika sel yang mengandung plasmid rekombinan ditumbuhkan atau berhasil tersisipi maka pada media LA tersebut, maka gen lac-Z tidak akan diekspresikan dan β-galaktosidase tidak akan terbentuk. Koloni akan berwarna putih (Brown 1995).

Hasil percobaan menunjukan tiga gambar yaitu kontrol positif digunakan untuk mengetahui kompetensi sel pada media tanpa ampisilin, control neatif menunjukan sel bakteri yang tidak tersisipi akan mati pada media LA dan ampisilin, kontrol transformasi  untuk mengukur tingkat keberhasilan transformasi X-gal dan IPTG. Morfologi bakteri  pada media yang berhasil tumbuh tersebut terlihat bulat dan saling bergerombol. Penggunaan kontrol positif dan kontrol negatif dalam transformasi berfungsi sebagai pembanding. Tingkat keberhasilan transformasi ditentukan oleh kompetensi sel. Ukuran, konsentrasi DNA.

 

Simpulan

Proses transformasi yang dilakukan pada sel bakteri Escherichia coli berhasil dilakukan ditandai dengan adanya koloni putih pada cawan media kontrol positif dan kontrol transformasi dengan media X-gal dan IPTG. Koloni yang berhasil tersisipi DNA insert ini akan berwarna putih. Seleksi bakteri pembawa DNA rekombinan dengan antibiotic ampisilin menunjukkan pada kontrol negatif tidak adanya koloni bakteri yang tumbuh, artinya bahwa bakteri yang digunakan tidak resisten terhadap antibiotik, jika tersisipi DNA insert bakteri ini akan resisten terhadap antibiotik.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s