ISOLASI (ELUSI) FRAGMEN DNA PLASMID DARI GEL AGAROSA

Standard

Pendahuluan

 

Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen DNA target dari campuran fragmen ‐ fragmen DNA pengotornya (Sunatmo 2009).

Teknik elusi disebut juga teknik preparasi gel elektroforesis, yang merupakan teknik isolasi fragmen DNA plasmid dari gel agarosa. Tujuan dilakukannya teknik elusi adalah untuk mengisolasi fragmen tunggal DNA yang diinginkan seperti untuk mengisolasi protein spesifik dalam intestin suatu organisme (Fitriyah 2006). Dalam isolasi fragmen tunggal DNA, biasanya fragmen DNA tersebut digunakan sebagai pelacak dalam mendeteksi DNA lain dan untuk dicangkokkan ke fragmen DNA lainnya.

Fragmen tunggal DNA yang diisolasi dengan teknik elusi bisa didapat dari hasil pemotongan DNA dengan enzim restriksi. Keberhasilan dari teknik ini akan terlihat ketika DNA vektor dan fragmennya ditransformasikan. Prinsip elusi dapat dikatakan juga melepaskan ikatan DNA dari gel agarosa, untuk itu dibutuhkan upaya dalam mencapainya. Cara yang dapat dilakukan antara lain, pemberian larutan penyangga elusi, penggunaan kertas membran Hybond N, pencacahan fragmen, dan dan pemberian larutan NaOAC. Fungsi dari larutan penyangga elusi ini yaitu menyesuaikan kondisi yang tepat bagi enzim agar bekerja secara maksimal dan menjaga keseimbangan sel agar tidak lisis (Lodish et al.1995).

 

Tujuan

Melakukan isolasi fragmen tunggal DNA plasmid dari gel agarosa.

 

Metode

 

Gel hasil elektroforesis plasmid dipotong pada bagian yang mengandung pita DNA yang sesuai dengan yang diinginkan, pemotongan dilakukan di atas transilluminator UV. Potongan gel dimasukkan ke dalam cawan petri kemudian dipotong – potong atau dicacah. Corong di letakkan di tabung eppendorf dan dilapisi membran nilon hybond N untuk menyaring gel. Membran nylon dibasahi dengan 50 µl larutan penyangga elusi. Hasil cacahan gel dimasukkan ke dalam corong yang telah dilapisi membran nylon hybond. Setelah itu, ditambahkan 150 µl larutan penyangga elusi melalui membran. Eppendorf disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 2 menit. 150 µl larutan penyangga elusi ditambahkan lagi lalu disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit. 100 µl larutan penyangga elusi ditambahkan kembali, lalu disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit. 500 µl filtrat yang terbentuk diendapkan dengan menambahkan 50 µl NaOAC dan 1000 µl alkohol absolut 100%. Didiamkan dalam freezer selama 30 menit, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit pada suhu 40C. Pelet yang dihasilkan dibilas dengan etanol 70% sebanyak 500 µl dan disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit, lalu dikeringkan dengan vakum. Endapan disuspensikan dengan menambahkan 10 µl dH20.

Pembahasan

 

Hasil pengamatan elektroforesis isolasi fragmen DNA menunjukan negatif untuk semua sumur, baik vektor maupun insert, kecuali 1 sumur yang berpendar dengan terang yaitu sumur ke 13 pada gel agarosa bagian atas (Gambar 1.b). Foto hasil elektroforesis tidak tampak jelas sehingga sulit dianalisis secara pasti hasil elusi ini dan praktikan tidak mengamati langsung pemotretan dari gel agarosa yang terlihat berpendar dengan bantuan ethidum bromida ini. Kemungkinan fragmen DNA lain yang tidak tampak berpendar karena fragmen DNA yang diisolasi terlalu sedikit sehingga ethidium bromida hanya mengikat DNA dalam jumlah sedikit sehingga tidak tampak jelas berpendarnya, atau karena yang diisolasi bukanlah fragmen DNA sebagaiman mestinya, tetapi hanyalah larutan atau bagian dari gel agarosa yang tidak tercacah halus. Tebal tipis fragmen DNA baik vektor atau insert dipengaruhi dari jumlah molekul DNA yang terisolasi.

Vektor merupakan molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi dari fragmen DNA asing tersebut. Sedangkan insert merupakan fragmen DNA yang akan disisipkan pada fragmen tertentu. Terdapat beberapa macam metode isolasi DNA plasmid sampai saat ini, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzymatic digestion. Isolasi yang digunakan pada praktikum ini adalah alkaline lysis, karena menggunakan larutan penyangga.

Senyawa yang digunakan dalam praktikum ini yaitu berupa larutan penyangga elusi yang terdiri dari Tris pH 7.5, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), H2O atau TE. Fungsi dari larutan penyangga elusi ini yaitu untuk menyesuaikan kondisi yang tepat bagi enzim agar bekerja secara maksimal dan menjaga keseimbangan sel agar tidak lisis (Lodish et al 1995). SDS merupakan suatu detergen fungsinya yaitu membantu proses pelisisan sel dengan cara melarutkan fosfolipid pada membran sel dan mendenaturasi protein sehingga membran sel akan mengalami kerusakan (Brown (1991).

Membran nilon hybond dikelompokkan menjadi dua, yaitu membran nilon hybon netral dan membran nilon hybond positif. Cara kerja dari membran nilon hybond netral adalah akan mengikat fragmen DNA secara sementara karena muatan DNA negatif dan muatan membrannya netral, ketika disentrifugasi fragmen akan turun, sehingga yang digunakan adalah filtrat yang tersaring pada tabung ependorf. Sedangkan membran hybond positif akan mengikat fragmen DNA sepenuhnya karena bermuatan positif sehingga yang akan digunakan adalah endapan yang tidak tersaring pada kertas membran. Fungsi adanya membran nilon hybond netral adalah untuk proses penyaringan. Membran ini harus dibasahi dahulu dengan buffer elusi dengan maksud menciptakan daya hantar atau gaya kohesi suatu zat.

Mengisolasi fragmen DNA dilakukan dengan proses pencacahan, hal ini dilakukan agar DNA lebih mudah lepas dai gel agarosa. Total jumlah volume buffer elusi yang digunakan adalah 450 µl, sedangkan filtrat yang digunakan sebanyak 500 µl, 50 µl sisanya diasumsikan berasal dari gel agarosa yang mengandung air. Penambahan NaOAC agar terjadi pengendapaan filtrat sedangkan penambahan etanol absolut untuk membantu pengikatan air dan pengendapan DNA. Pada praktikum digunakan membran nilon hybon netral yang masih tergolong cara sederhana. Keuntungan yang didapat dari cara sederhana ini adalah harganya relatif terjangkau sedangkan kekurangannya adalah waktu yang dibutuhkan untuk mengisolasi fragmen DNA lebih lama. Untuk efisiensi waktu sekarang telah banyak perangkat atau kit yang dapat dimanfaatkan dalam isolasi fragmen tunggal DNA, antara lain GFXTM PCR DNA dan Gel Band Purification kit dari Amersham Pharmacia Biotech namun kekurangannya harganya cukup mahal untuk menggunakan kit ini.

 

Simpulan

 

            Teknik elusi atau preparasi gel elektroforesis merupakan teknik isolasi fragmen DNA plasmid dari gel agarosa. Hasil percobaan yang dilakukan tidak berhasil sepenuhnya karena hasil foto menunjukan negatif untuk semua sumur, baik vektor maupun insert, kecuali 1 sumur yang berpendar dengan terang yaitu sumur ke 13 pada gel agarosa bagian atas. Hasil elektroforesis tidak tampak jelas sehingga sulit dianalisis secara pasti dan praktikan tidak mengamati langsung pemotretan dari gel agarosa. Kemungkinan fragmen DNA lain yang tidak tampak berpendar, karena fragmen DNA yang diisolasi terlalu sedikit atau karena yang diisolasi bukanlah fragmen DNA sebagaiman mestinya.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s