ISOLASI PLASMID DAN ELEKTROFORESIS PADA GEL AGAROSA

Standard

Pendahuluan

Plasmid merupakan DNA sirkuler untai ganda ekstra kromosomal dengan ukuran bervariasi antara 1 kb sampai lebih dari 1000 kb ditemukan pada berbagai spesies bakteri yang dipakai sebagai unit gen untuk melakukan replikasi (Sambrook et al. 2001). Jumlah plasmid pada suatu spesies berbeda dengan spesies lain dan ukurannya relatif kecil bila dibandingkan dengan ukuran kromosom  (Jusuf 2001). Contoh bakteri yang memiliki plasmid dan digunakan pada praktikum ini adalah Escherichia coli.

Elektroforesis merupakan suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel bermuatan dalam suatu medan listrik.  Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel bermuatan negatif menuju kutub positif. Elektroforesis menggunakan sumber arus listrik searah, ruang untuk elektroforesis (Comb Well, platform dan cetakan wadah gel), larutan buffer, matriks elektroforesis, marker dan gel (Klug & Cummings 1994). Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk pemisahan protein dan asam nukleat (DNA).

Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel.  Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya.  Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui matriks tersebut (Brown 1992).

Asam nukleat laju migrasinya berbanding terbalik dengan ukuran molekulnya. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif. Semakin besar ukuran molekulnya, semakin rendah  laju  migrasinya. Semakin tinggi konsentrasi media semakin lambat kecepatan DNA, sedangkan jika arus dinaikan maka semakin cepat pergerakan DNA (Campbell at al. 2002).

 

Tujuan

Mengetahui dan dapat mengisolasi plasmid untuk vektor kloning serta mengetahui cara mendeteksi DNA dengan gel agarosa.

Pembahasan

Praktikum ini melakukan isolasi plasmid dari bakteri Escherichia coli. Foto hasil percobaan elektroforesis dari isolasi plasmid ini menjelaskan terdapat tiga belas sumur dalam gel agarosa. Sumur pertama adalah λ dan sumur dua adalah Pgem yang merupakan DNA . Sumur tiga, lima, tujuh, delapan, sembilan, sepuluh, sebelas dan sumur tiga belas terlihat adanya pergerakan molekul DNA plasmid dalam gel agarosa dengan masing-masing kecepatan yang berbeda satu sama lain. Pergerakan ini ditandai dengan berpendarnya ethidium bromida pada ruang UV. DNA plasmid dapat mengikat zat ethidium bromida dan zat ini dapat berpendar jika terkena sinar UV. Sedangkan sumur empat, enam, dan sumur dua belas tidak terdapat pergerakan molekul DNA atau hasilnya negatif, kemungkinan disebabkan oleh plasmid DNA yang diisolasi terlalu sedikit sehingga pergerakannya tidak terlihat.

Mengisolasi DNA dapat digunakan tiga larutan. Larutan A yang berfungsi resupinasi pelet sehingga menjadi suspensi yang rata. larutan B yang berfungsi sebagai larutan lisis berisi sodium dodecyl sulfat (SDS) untuk memecah membran dan larutan NaOH untuk denaturasi DNA. Selain larutan di atas terdapat larutan C yang berfungsi sebagai larutan netralisasi biasanya berisi potassium asetat unuk menetralisir NaOH dan konversi SDS terlarut menjadi tidak terlarut.

Larutan EDTA berfungsi sebagai larutan buffer dan sebagai pengkelat yang dapat mengikat ikatan kation sehingga dapat menurunkan tegangan dan menghasilkan ion untuk menghantarkan arus. Endapan yang telah tersuspensi diberi larutan NaOH dan SDS. Tujuan pemberian larutan ini untuk melisiskan bakteri dan menaikkan pHnya. Setelah lisis bakteri diberi larutan sodium asetat yang berfungsi untuk menetralisasi serta menurunkan pH. Larutan lain selain ketiga larutan di atas tersebut adalah cairan DNA plasmid diekstrak dengan larutan PCI (Fenol/Kloroform/Isoamilalkohol) dan diberi etanol 70% untuk menghilangkan kandungan garamnya. Proses elektroforesis, DNA yang akan dimigrasikan dicampur dengan larutan loading dye dan blue bromophenol. Hal ini untuk menandai laju migrasi DNA dan sebagai larutan pewarna.

Langkah selanjutnya setelah proses elektroforesis adalah merendam gel agarosa dalam larutan ethidium bromida yang bersifat karsinogenik. Penggunaan gel agarosa dimaksudkan untuk mengisolasi DNA dan RNA yang umumnya berukuran 100 bp sampai 10 kb. Keuntungan menggunakan agarosa adalah tidak bersifat karsinogenik seperti halnya acrylamide. Larutan ethidium bromida mengikat DNA plasmid, sehingga ketika larutan ini bereaksi dengan plasmid dan diletakan dalam ruang UV akan menyebabkan berpendarnya ethidium bromida dalam gel. Berpendarnya senyawa ini dapat menjadi indikator pergerakan DNA plasid dalam gel.

 

Simpulan

            Hasil pengamatan sumur kelompok kami menandakan tidak adanya pergerakan atau negatif, hal tersebut disebabkan karena jumlah DNA plasmid yang diisolasi kurang mencukupi standar sehingga tidak terlihat pergerakannya. DNA plasmid yang memiliki pergerakan positif ditandai dengan indikator berpendarnya ethidium bromida dalam gel agarosa saat berada di ruang UV.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s