LIGASI

Standard

Pendahuluan

Ligasi merupakan proses memasukan sekuens DNA yang mengandung gen yang diinginkan ke dalam DNA genom (Sunatmo  2009). Ligasi menghasilkan produk yang disebut dengan DNA rekombinan (Voet D & Voet JG 1994). DNA ligase merupakan enzim yang dapat mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5’-fosfat dan 3’-hidroksil yang digunakan saat proses ligasi pada DNA yang mengalami pemotongan dengan enzim restriksi sebelumnya (Gul S et al. 2004). DNA ligase diperlukan untuk menggabungkan fragmen Okazaki saat proses replikasi, menyambung potongan-potongan DNA yang baru disintesis, serta berperan dalam proses reparasi DNA, Oleh karena pentingnya DNA ligase, sekarang ini telah dikembangkan obat antibakterial yang menginhibisi DNA ligase (Miesel L et al. 2002).

DNA ligase dapat digolongkan menjadi 2 jenis berdasarkan kofaktor yang diperlukan, yaitu NAD+ atau ATP.DNA ligase NAD+dependent ditemukan hanya di bakteri, Sementara DNA ligase ATP-dependent ditemukan di bakteriofageeubacteriaarchaea, dan virus.  DNA ligase ATP-dependent yang umum adalah T4 DNA ligase dan T7 DNA ligase (Gul S et al. 2004). DNA ligase yang digunakan dalam praktikum adalah T4 DNA ligase berasal dari T4 bakteriofage. Enzim ini akan meligasi fragmen DNA yang menggantung, memiliki ujung kohesif maupun ujung tumpul. Proses meligasi fragmen DNA yang memiliki ujung tumpul, diperlukan konsentrasi enzim yang lebih besar (Bowen 2002).

 

Tujuan

Percobaan ini bertujuan melakukan penyambungan dua fragmen DNA.

Pembahasan

Ligasi merupakan proses memasukkan sekuens DNA yang mengandung gen yang diinginkan ke dalam DNA genom. Proses ligasi ini dapat dilihat ketika proses transformasi. Hasil transformasi terlihat bahwa koloni berwarna putih terbentuk pada cawan dengan penambahan X-gal dan IPTG serta pada kontrol positif tanpa perlakuan. Hasil ini sesuai dengan literatur yang mengatakan, terbentuknya koloni berwarna putih ini berarti sel bakteri mengandung DNA plasmid rekombinan dan proses ligasi dinyatakan berhasil (Brown 1995). Jika proses ligasi atau penyambungan fragmen DNA tidak berhasil ditandai dengan warna koloni berwarna biru, sehingga dapat dikatakan percobaan meligasikan fragmen DNA berhasil dilakukan karena terdapat koloni putih.

Proses ligasi yang tidak dapat terlihat itu dilakukan dalam tabung epedorf. Setelah campuran berbagai larutan dengan DNA vektor dan insertnya akan disuspensikan agar merata. Proses selanjutnya adalah inkubasi campuran larutan itu pada suhu 4 ºC selama satu malam. Namun, Suhu optimum aktivitas DNA ligase adalah pada suhu 37ºC, tetapi pada suhu tersebut ikatan hidrogen yang terbentuk di antara ujung lancip menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut dan mengakibatkan denaturasi. Maka, alternatif yag baik dilakukan dalam proses ini adalah inkubasi pada suhu yang diturunkan misalnya antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi yang diperpanjang.

Proses ligasi yang dilakukan dengan bantuan enzim T4 DNA ligase. Fungsi dari T4 DNA ligase adalah untuk menyambungkan fragmen-fragmen DNA pendek menjadi DNA utuh yang disebut dengan DNA rekombinan. Enzim ini berasal dari T4 bakteriofage dan dapat meligasi fragmen DNA yang menggantung, memiliki ujung kohesif maupun ujung tumpul. Proses meligasi fragmen DNA yang memiliki ujung tumpul, diperlukan konsentrasi enzim yang lebih besar (Bowen 2002).

Simpulan

Ligasi merupakan proses memasukan sekuens DNA yang mengandung gen yang diinginkan ke dalam DNA genom. Enzim yang digunakan pada praktikum T4 DNA ligase dan proses inkubasi campuran larutan itu pada suhu 4 ºC selama satu malam. Percobaan meligasikan fragmen DNA berhasil dilakukan ditandai dengan terbentuknya koloni putih pada proses transformasi dan diartikan mengandung plasmid rekombinan.

 

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s