PEMOTONGAN DNA DENGAN ENZIM RETRIKSI

Standard

Pendahuluan

 

Enzim restriksi adalah enzim yang bekerja untuk memotong fragmen DNA pada situs spesifik (Sunatmo 2009). Sekuen pengenalan atau situs pengenalan merupakan sekuen DNA yang menjadi tempat menempelnya enzim restriksi dan melakukan pemotongan pada sekuen tersebut (Pray 2008). Setiap enzim mempunyai sekuens pengenalan yang unik pada utas DNA, biasanya sepanjang 4-6 pasang basa (Philips 2010). Situs pengenalan bersifat palindrome, merupakan daerah yang memiliki urutan basa yang sama dengan utas pasangannya jika dibaca dari arah yang sama yaitu 5’ – 3’ (Suharsono & Widyastuti 2006).

Enzim restriksi memotong DNA double strands dengan memutus ikatan kovalen di antara fospat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya. Terdapat dua tipe hasil pemotongan, ujung rata (blunt end) dan ujung kohesif (sticky end). Ujung rata (blunt end) dihasilkan ketika dua utas molekul dipotong pada posisi yang sama, bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan. Ujung kohesif (sticky end) dihasilkan ketika setiap molekul DNA dipotong pada posisi yang tidak sama sehingga salah satu utas (5’ atau 3’) menggantung dengan beberapa nukleotida. Akhiran single strand yang tidak rata ini dapat berpasangan secara spontan dengan basa pasangannya sehingga disebut sticky (mudah lengket) atau kohesif (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

Enzim restriksi memiliki tiga tipe, tipe I memotong DNA secara acak dan jauh dari sekuens pengenalannya, tipe II memotong DNA dekat atau pada situs pengenalan, enzim tipe II yang umum digunakan adalah HhaI, HindIII, EcoRI, dan NotI (Sasnauskas G et al. 2007). Tipe III tidak digunakan dalam laboratorium. Hal ini dikarenakan enzim ini memotong di luar situs pengenalan dan membutuhkan dua sekuen dengan orientasi berlawanan pada DNA yang sama untuk menyelesaikan pemotongan sehingga enzim ini jarang menghasilkan potongan sempurna (Rinehart 2005). Enzim restriksi EcoRI mendeskripsikan bakteri Escherichia coli strain RY13 dan Urutan I enzim yang ditemukan pada bakteri ini. Enzim ini termasuk subtipe ortodoks, yang memotong pada situs pengenalan urutan heksanukleotida 5’- GAATTC-3’ (Pingoud & Jeltsch 2001).

 

Tujuan

Mengetahui dan melakukan pemotongan DNA dengan enzim restriksi.

 

Metode

Restriksi dilakukan dengan menggunakan sampel dengan komposisi 4 µl DNA plasmid, 2 µl buffer 10x, 0.5 µl enzim EcoRI dan 13,5 µl ddH2O, sehingga larutan sampel yang diperoleh adalah 20 µl di dalam masing‐masing tabung. Kemudian, larutan diinkubasi pada suhu 370C selama satu malam, kemudian di elektroforesis 30 menit dalam gel agarosa dan difoto serta dianalisis.

Pembahasan

 

Enzim restriksi yang digunakan pada percobaan ini adalah EcoRI. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC. Di dalam sekuens pengenal tersebut, enzim EcoRI memotongnya tidak pada sembarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan A. Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memiliki ujung berutas tunggal (Pingoud & Jeltsch 2001).

Visualisasi hasil pemotongan DNA restriksi terdapat vektor dan fragmen DNA. Vektor biasanya berukuran lebih besar karena vektor biasanya berbentuk Nicked open circular yang merupakan DNA dengan satu untai yang terpotong. Sedangkan fragmen atau insert kemungkinan DNAnya berbentuk linear yang merupakan DNA dengan ujung bebas dan kedua untai yang telah terpotong (Brown 1991). Bentuk DNA inilah yang menyebabkan kecepatan DNA plasmid menjadi berbeda-beda. Semakin kecil ukuran DNA maka semakin cepat terjadinya migrasi. Hal ini yang menyebabkan DNA vektor berada di atas dan DNA insert atau fragmen berada di bawah. Hasil foto elektroforesis pemotongan DNA terlihat berhasil seluruhnya karena terbentuk dua bagian antara vektor dan insert yang berbeda letaknya dalam gel agarosa, walaupun ketajaman gambar tidak terlalu jelas. Perbedaan tebal tipisnya fragmen DNA baik vektor atau insert dipengaruhi dari jumlah molekul DNA yang terisolasi, semakin banyak maka akan semakin terlihat jelas berpendarnya, begitupula sebaliknya.

Enzim restriksi pada umumnya bekerja pada pH 7.4, suhu 370C dan memerlukan bermacam-macam kekuatan ionik, tergantung dari jenis enzimnya. Beberapa enzim memerlukan optimasi khusus agar proses restriksi berjalan dengan baik, biasanya dikemas bersama dengan 10x larutan penyangga reaksi yang telah dioptimasi. EcoRI memiliki kandungan garam tinggi namun aktif pada keadaan garam sedang sehingga digunakan larutan penyangga KCl dan NaCl. Kondisi optimal ketika melakukan proses digesti sangat penting. Karena jika kondisi optimal tidak tercapai, enzim akan memotong secara tidak normal (Rinehart 2005).

 

Simpulan

 

Pemotongan DNA berhasil dilakukan dengan bantuan enzim EcoRI, sehingga terbentuk dua bagian, vektor dan insert. Semakin kecil ukuran DNA maka semakin cepat terjadinya migrasi. Hal ini yang menyebabkan DNA vektor berada di atas dan DNA insert atau fragmen berada di bawah karena vektor berukuran lebih besar daripada insert.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s