POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Standard

Pendahuluan

Reaksi rantai polymerase (PCR) merupakan teknik ilmiah dalam biologi molekuler untuk memperkuat satu atau beberapa salinan potongan DNA  dan dapat menghasilkan ribuan sampai jutaan salinan urutan DNA tertentu (Bartlett & Stirling 2003). PCR sekarang menjadi teknik umum dan sering diperlukan dalam laboratorium penelitian medis atau biologi untuk berbagai aplikasi, termasuk cloning untuk sekuensing DNA, filogeni DNA, analisis fungsional gen, diagnosis dan deteksi penyakit menular (Saiki RK et al. 1988).

PCR memerlukan beberapa komponen dan reagen (Oseph 2001). Komponen-komponen ini meliput, DNA template yang berisi wilayah DNA (target), Dua primer (reverse dan forward), Taq polymerase, Deoxynucleoside trifosfat (dNTP),  divalen kation (Mg2 +, Mn2 +) (Pavlov 2004). Perbanyakan DNA dengan menggunakan PCR meliputi beberapa langkah antara lain, denaturasi atau inisiasi yang dapat optimum dengan adanya pemanasan (Rychlik 1990), anneling atau penempelan primer, dan proses pemanjangan rantai nukleotida. Perlakuan panas pada proses denaturasi menyebabkan ikatan hidrogen yang membentuk struktur untai ganda mengalami kerusakan dan berubah menjadi molekul untai tunggal.

 

 

Tujuan

Praktikum ini bertujuan  mengetahui cara perbanyakan DNA dengan PCR.

 

Metode

  1. Seleksi

Satu koloni bakteri hasil transformasi yang diduga rekombinan diambil dengan tusuk gigi steril. Selanjutnya tusuk gigi tersebut digoreskan pada media agar yang baru sebagai replika dari koloni yang diambil. Tusuk gigi kemudian dicelupkan ke tabung PCR yang berisi 6 μl ddH2O dan dipanaskan pada 95oC selama 10 menit. Setelah dipanaskan, tabung diinkubasi dalam es selama 2-5 menit. Selanjutnya diteruskan ke tahap PCR koloni.

2. PCR koloni

Tabung PCR pada metode pertama ditambahkan komponen PCR yaitu, buffer enzim Taq polimerase, dNTP mix, enzim Taq polimerase, primer reverse dan primer forward masing-masing sebanyak 0,3 μl, serta akuades steril hingga total volume DNA contoh menjadi 10 μl. Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR dan memasuki tahap predenaturasi dengan suhu 95 oC selama 5 menit. Selanjutnya memasuki siklus PCR dengan tahapan sebagai berikut, denaturasi 1 menit pada 95 oC, kemudian annealing selama 30 detik pada suhu 55 oC, dan sintesis selama 2 menit pada 72 oC. Siklus tersebut dilakukan sebanyak 30 kali. Setelah proses tersebut selesai, dilanjutkan dengan pasca sintesis pada 72 oC selama 5 menit dan 15 oC selama 10 menit. Tahap akhir, hasil PCR dideteksi dengan elektroforesis.

Pembahasan

Teknik perbanyakan DNA dengan cara PCR terjadi melalui beberapa tahap antara lain denaturasi, annealing, dan reaksi polimerisasi (ekstensi). Denaturasi terjadi apabila molekul DNA untai ganda dipanaskan atau diperlakukan dengan alkali. Perlakuan tersebut menyebabkan ikatan hidrogen yang membentuk struktur untai ganda mengalami kerusakan dan berubah menjadi molekul untai tunggal. Pada saat praktikum suhu yang digunakan adalah 95 oC selama satu menit untuk proses denaturasi ini. Annealing merupakan tahapan penempelan primer oligonukelotida pada sekuens yang komplementer pada DNA cetakan dapat dibantu dengan penurunan suhu sampai pada suhu 52 oC. tahapan yang terakhir adalah pemanjangan rantai nukleotida, sintesis DNA yang komplemen dengan DNA cetakan proses ini  dapat dibantu dengan menaikan suhu sampai 72 oC.

Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan komponen pendukung agar tercipta perbanyakan DNA secara cepat. Komponen tersebut antara lain, template DNA, enzim Taq polimerase, primer fragmen DNA forward dan reverse, dNTP, DMSO buffer mengandung MgCl2, dan akuades. Template DNA adalah molekul DNA untai ganda yang mengandung sekuen target yang akan diamplifikasi dan memiliki peranan penting dalam keberhasilan PCR karena konsentrasi dan kemurnian template dapat mempengaruhi hasil reaksi. Enzim Taq polimerase berperan dalam proses amplifikasi, jika konsentrasinya rendah, enzim ini mengakibatkan proses amplifikasi berlangsung inefisien dan produk amplifikasi memiliki konsentrasi yang relatif rendah. Susunan primer juga merupakan kunci keberhasilan PCR. Ujung 3’ primer penting dalam menentukan sensitivitas PCR, ujung tersebut tidak boleh memiliki 3 atau lebih basa G atau C karena dapat menstabilisasi annealing primer non spesifik. Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) berperan dalam sintesis untai DNA komplementer. Konsentrasi ion Mg2+ dalam buffer juga merupakan hal yang sangat penting. Hal ini karena ion Mg2+ dapat mempengaruhi proses annealing primer, spesifisitas produk, pembentukan primer-dimer, serta aktivitas dan ketepatan enzim (Sulistyaningsih E 2007). DMSO (Dimethyl sulfoxide) berfungsi sebagai antioksidan yang menjaga agar struktur DNA tidak rusak karena pemanasan atau perlakuan kimia.

Hasil elektroforesis menggunakan gel agarose sebagian besar kelompok praktikum berhasil ditandai dengan terdapatnya pita yang berpendar akibat bereaksi dengan Ethidium bromida. Namun kelompok lainnya seperti kelompok 4, 6, 8, 10, dan 22 tidak menunjukan pendaran terang seperti layaknya pta kelompok lainnya. Hal ini menandakan DNA yang dimigrasikan kurang banyak karena masih terlihat pita sangat tipis pada hasil pemotretan atau ketika mengambil sampel berisi DNA, bukan DNAnya yang terambil hanya pelarut saja.

Simpulan

Teknik PCR digunakan untuk perbanyak DNAsecara lebih cepat dan menghasilkan lebih banyak. Diperlukan komponen pendukung untuk melakukan teknik ini. Teknik ini dikatakan berhasil ketika dilakukan elektroforesis menggunakan gel agarose terdapat pendaran pada gel berbentuk pita. keberhasilan teknik ini dipengaruhi Template DNA (konsentrasi dan kemurnian template). Ketidakberhasilan proses ini ditandai dengan tidak adanya pita dalam gel yang berpendar karena interaksi DNA dengan ethidium Brmida.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s